Expression of Interleukin-1 Alpha and Tumor Necrosis Factor-alpha Related to the Degree of Bone Resorption in Aural Cholesteatoma

Kim, Hae Young; Chun, Jin Hyoung; Hong, Hyun Jeong; Kim, Hyung-Jong

Original Article

Auditory and vestibular disorders

Korean Journal of Audiology 2006;10(2):150-156.

Expression of Interleukin-1 Alpha and Tumor Necrosis Factor-alpha Related to the Degree of Bone Resorption in Aural Cholesteatoma

Hae Young Kim, Jin Hyoung Chun, Hyun Jeong Hong, Hyung-Jong Kim

Department of Otolaryngology, Hallym University College of Medicine, Anyang, Korea

중이 진주종에서 골파괴와 관련된 Interleukin-1 Alpha 및 Tumor Necrosis Factor-alpha의 발현에 관한 연구

김해영^, 전진형^, 홍현정^, 김형종

한림대학교 의과대학 이비인후과학교실

Abstract

Background and Objectives：Cytokines are reported to play an important role in bone resorptive process in chronic otitis media with or without aural cholesteatoma. The object of this study was to measure quantitatively the expression of interleukin-1 alpha (IL-1α) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) with regard to the degree of bone resorption occured in chronic otitis media.

Materials and Methods：Eighteen cholesteatomas and fourteen mucosa granulation tissues were collected from chronic otitis media with or without cholesteatoma. The degree of bone resorption was classified clinically using with radiologic and operation findings. The activities of IL-1α and TNF-α were measured by enzyme-linked immunosorbent assay. As control group, deep external auditory canal skins were collected from seven patients. ANOVA test was used for comparisons among the groups (p<0.05).

Results：The levels of IL-1α and TNF-α in cholesteatoma were significantly greater than those in non-cholesteatoma group and control group. In addition, there were also significant differences of these cytokine levels between the group of chronic otitis media with bone resorption and the group without bone resorption.

Conclusion：Cytokines may play a role in the bone resorption in aural cholesteatoma.

Keywords: Cholesteatoma;Cytokine;Bone resorption.

교신저자：김형종, 431-070 경기도 안양시 동안구 평촌동 896
교신저자：전화) (031) 380-3840, 전송) (031) 386-3860, E-mail：hjk1000@hallym.ac.kr

서 론

심한 중이의 염증은 주변 골조직의 파괴를 초래함으로써 난청, 전정기능장애, 안면신경마비의 증상이나 생명을 위협하는 두개내 합병증까지 유발할 수 있으며, 골파괴는 중이진주종(이하 진주종으로 약함)의 80%, 비진주종성 만성중이염(이하 비진주종으로 약함)의 10% 정도에서 발생한다고 한다.¹⁾ 이러한 골파괴가 일어나는 기전에 대하여 명확하게 밝혀져 있지 않지만 중이의 만성적 염증에 의한 골수염, 진주종 자체의 압력에 의한 괴사, 단핵구에 의한 골흡수 또는, 육아조직에서 분비되는 collagenase, acid phosphatase 및 acid protease 등의 효소에 의한 기전이 골파괴에 관여할 것으로 생각되어 왔고 최근에는 염증성 사이토카인에 의한 파골세포의 활성화가 진주종에서 골흡수를 일으키는 중요한 기전으로 보고되고 있다.²⁾ Interleukin-1 alpha(IL-1α)는 잘 알려진 염증성 매개체인 사이토카인으로서 파골세포를 활성화 시켜 골파괴에 중요한 역할을 하고, 섬유아세포를 포함한 다른 염증세포들도 함께 자극하는 것으로 알려져 있으며 단핵구, 대식세포, 각질세포(keratinocyte)에서 분비되는 것으로 보고되었다.²⁾³⁾ 한편 단핵구와 대식세포 및 진주종 각질세포 등에서 생성되며 염증반응에 중요한 역할을 하는 또 다른 사이토카인으로 Tumor necrosis factor-alpha(TNF-α)가 있다. TNF-α는 조직 괴사나 응고의 기전을 통해 악성종양 세포의 증식을 억제하는 역할을 한다고 일반적으로 알려져 있다. 또한, TNF-α는 대식세포를 자극해서 collagenase, acid phosphatase, acid protease 등의 생성을 촉진함으로써 섬유아세포를 통한 prostaglandin E2의 생성을 촉진하고 연골세포에 의한 교원질의 합성을 억제하는 작용이 있다.⁴⁾ 염증 환경에서 IL-1α와 TNF-α는 서로 상승작용을 보이고 prostaglandin 및 다양한 growth factor 등과 함께 진주종 상피세포의 증식과 파골세포의 활성화를 통한 골파괴 작용을 매개한다고 알려져 있다.⁵⁾
본 연구는 진주종과 비진주종에서 IL-1α와 TNF-α의 농도를 각각 측정 비교하고 실제 관찰된 골 파괴 정도와의 관련성을 연구함으로써 사이토카인과 관련된 중이염의 골파괴 기전에 대한 기초자료를 얻고자 계획되었다.

재료 및 방법

연구대상

2006년 2월부터 2006년 9월까지 한림대학교성심병원에서 염증을 동반한 만성화농성중이염으로 진단되어 유양돌기절제술 및 고실성형술을 시행받은 32례를 연구대상으로 하였다. 연구대상 32례중 18례는 진주종이었고, 14례는 비진주종이었으며 나이는 22세부터 68세까지 평균 47세였다. 성별은 진주종군에서 남자가 4명, 여자가 14명이었고 비진주종군에서는 남자가 4명, 여자가 10명이었다. 실험에 사용할 조직으로서 수술시 진주종군에서는 진주종 조직을 채취하였고, 비진주종군에서는 중이유양동의 점막 및 육아조직을 채취하여 보관하였다. 대조군으로 사용할 조직으로서는 환자 10례의 심부 외이도 피부조직을 얻었다. 채취된 조직은 즉시 액화질소로 동결하였으며 멸균된 1 ml Eppendorf tube에 넣어 각각 고유번호를 붙인 후 사이토카인 측정실험 전까지 영하 70℃ 이하에서 보관하였다.

연구방법

사이토카인의 측정
동결 보관된 조직을 해동한 후 electronic balance로 무게를 측정하여 30 mg 당 0.55 M sucrose가 함유된 0.1% Triton-X 100 용액 1 ml를 넣은 후 sonicator (Sonics & Materials Vibra cell)를 이용하여 2분간 균질화 하였다. 그 후 4℃에서 10,000 rpm으로 15분간 원심 분리한 뒤 상층액을 채취하였다. 채취한 상층액을 멸균 소독된 Eppendorf tube로 옮긴 후 IL-1α, TNF-α의 활성도를 효소결합면역흡착검사(ELISA, BioSource International, California, USA) kit를 이용하여 측정하였다. 이 검사 kit에 의해 측정 가능한 IL-1α, TNF-α의 최소 표준 농도는 각각 7.8 pg/ml, 1.7 pg/ml 였다.

골파괴 정도의 분류
술전 측두골전산화단층촬영 소견과 수술시 관찰한 소견을 바탕으로 고실개(tegmen tympani), 경판(scutum), 이소골(ossicle), 안면신경관(facial nerve canal)에서 골파괴 소견의 유무를 확인하여 기록하였다. 어떤 부위에서도 골파괴가 확인되지 않은 경우는 grade 0, 한 부위에서 골파괴가 확인된 경우는 grade 1, 두 부위에서 골파괴가 확인된 경우는 grade 2, 세 부위 이상에서 골 파괴가 확인된 경우는 grade 3으로서 분류하였다.

통계학적 검정
통계학적 분석은 Window용 SPSS version 12(SPSS Inc, Chicago, USA)를 이용하였고, 유의성 검정은 ANOVA test에 의해 판정하였다(p<0.05).

결     과

IL-1α 및 TNF-α의 농도 비교

본 연구에 사용된 진주종 조직 및 점막이 포함된 육아조직 그리고 심부 외이도 피부조직 모두에서 IL-1α와 TNF-α의 활성도가 측정되었다. 진주종군에서 측정된 농도는 IL-1α가 402.1±79.6 pg/ml이었고 TNF-α의 농도는 27.2±5.4 pg/ml 이었다. 비진주종군에서는 IL-1α가 9.1±2.9 pg/ml, TNF-α의 농도는 10.1±6.1 pg/ml으로(Figs. 1 and 2) 이 두 군 간에 IL-1α와 TNF-α의 농도 차이는 각각 통계학적으로 유의하였다(p<0.05). 대조군으로 사용한 외이도 피부조직에서 IL-1α는 2.1±0.4 pg/ml, TNF-α는 4.2±1.3 pg/ml 으로 진주종군과 외이도 피부군 간 농도의 차이는 통계학적으로 유의하였다(p<0.05). 한편, 비진주종군과 외이도 피부간 비교에서 IL-1α는 두 군간에 유의한 차이를 보였으나(p<0.05), TNF-α는 유의한 차이을 보이지 않았다(p>0.05).

IL-1α 및 TNF-α의 농도와 골파괴 정도의 상관관계

진주종군에서는 총 18례 중 모든 례에서 최소 한 부위 이상의 골파괴 소견이 확인되었고, 비진주종군에서는 총 14례 중 골파괴가 없는 grade 0가 10례, grade 1이 4례 였다. 진주종군에서 골파괴 정도에 따라 grade 1이 4례, grade 2가 6례, grade 3가 8례의 분포를 보였고, 골파괴 정도에 따라 IL-1α의 농도를 비교하였을 때 각각 grade 1이 876.4±57.5 pg/ml, grade 2가 406.8±127.5 pg/ml, grade 3가 161.5±30.1 pg/ml 로 한 부위에서 골파괴가 관찰된 grade 1의 농도가 두 부위 이상에서 골파괴가 관찰된 grade 2, grade 3의 농도보다 유의하게 높은 것으로 관찰되었다(p>0.05)(Fig. 3). TNF-α의 농도를 비교하였을 때 각각 grade 1이 12.1±1.5 pg/ml, grade 2가 40.6±6.1 pg/ml, grade 3가 24.7±9.3 pg/ml으로 TNF-α의 농도와 골파괴 정도 간의 상관관계는 발견되지 않았다(Fig. 4).
비진주종군에서는 골파괴가 관찰된 군에서 측정된 IL- 1α의 농도가 14.5±3.9 pg/ml, TNF-α의 농도는 8.1±2.3 pg/ml이었고 골파괴가 관찰되지 않은 군에서 측정된 IL-1α의 농도가 8.2±2.6 pg/ml, TNF-α의 농도는 10.9±1.6 pg/ml으로 골파괴가 관찰된 군과 관찰되지 않는 군 간에 IL-1α와 TNF-α의 농도의 상관관계는 발견되지 않았다.
한편, 진주종군과 비진주종군에서 골파괴 정도에 따른 IL-1α의 농도를 비교해보면 진주종군 grade 1의 IL-1α의 농도가 876.4±57.5 pg/ml, 비진주종군 grade 1의 IL-1α의 농도가 14.5±3.9 pg/ml로 골파괴 정도가 비슷할 경우 진주종군에서 비진주종군에 비해 IL-1α의 농도가 유의하게 높게 관찰되었다(p>0.05)(Fig. 5). 반면에 TNF-α의 경우는 진주종군 grade 1의 TNF-α 농도가 12.1±1.5 pg/ml이고 비진주종군 grade 1의 TNF-α 농도가 8.1±2.3 pg/ml으로 상관관계가 발견되지 않았다(Fig. 6).
전체 중이염 환자군 중 진주종군 18례와 비진주종군에서 골파괴가 관찰된 4례를 포함하여 골파괴가 관찰된 22례와 골 파괴가 없었던 10례를 비교하였을 때 골파괴가 있는 군에서 IL-1α는 332.6±339.5 pg/ml, TNF-α는 23.7±21.7 pg/ml였고, 골파괴가 없는 군에서 IL-1α 4.2±2.6 pg/ml, TNF-α는 10.9±3.1 pg/ml으로 측정되어 골파괴가 있는 군에서 골파괴가 없는 군보다 IL-1α 및 TNF-α의 농도가 유의하게 높은 것으로 관찰되었다(Figs. 7 and 8).

고     찰

골파괴는 심한 염증을 동반한 만성 화농성 중이염에서 볼 수 있는 소견이며, 특히 진주종 병변에서 발생빈도가 높다. 진주종에서 골파괴가 발생하는 기전으로서 진주종 덩어리에 의한 압력효과가 골파괴를 일으키는 주된 원인으로 생각되어 왔고,⁶⁾ 중이염의 골조직 근처에 존재하는 다량의 조직구에서 분비된 acid phosphatase, protease 등의 효소에 의해서 골파괴가 일어나는 것이 확인됨으로써 효소에 의한 골파괴 기전도 알려지게 되었다.⁷⁾ 최근 각종 사이토카인에 의해 매개된 염증반응에 의해서도 골파괴가 발생하는 것으로 알려지고 있다. 특히, 진주종 환자의 파괴된 골조직 근처에는 대식구, 림프구, 상피세포, 내피세포 및 섬유아세포 등이 존재하여 다양한 사이토카인이 분비되며 이들 사이토카인은 혈관을 확장시키고 투과성을 증가시키며 염증매개물질을 분비시키고 육아조직을 증식시킴으로써 골파괴를 유발하게 된다. Moriyama 등⁸⁾은 진주종 조직의 각질이 이물반응을 일으켜 사이토카인의 분비를 촉진하고 세균감염시 면역반응으로서 사이토카인의 분비를 유발할 수 있다고 하였다.
골파괴와 관련 있는 사이토카인으로 IL-1, 6와 TNF- α가 알려져 있고 그 밖에 단백질 매개체로 여러 종류의 growth factor, prostaglandin 등이 있으며 산화질소와 신경전달물질도 골파괴에 관여한다.⁹⁾ IL-1α와 IL- 1β로 구성되어 있는 IL-1는 상피의 각질형성세포(keratinocyte)와 진주종 조직에서 보이는 염증세포의 작용을 활성화 시키고 prostaglandin을 활성화시켜 골파괴를 일으킨다. TNF-α는 진주종에서 특이하게 관찰되는 각질이나 그람 음성균의 세포벽에 존재하는 lipopolysaccharide에 의해 활성을 띄게 되고 IL-1, 6의 작용을 항진시키고 각질형성세포의 분화와 성장을 촉진한다고 보고되었다.¹⁰⁾
본 연구는 골흡수와 관련된 사이토카인 중 IL-1α와 TNF-α 활성도를 통해 진주종의 골파괴 정도를 분석하고자 하였다. 이번 실험에서 IL-1α의 활성도는 진주종군에서 비진주종군과 대조군에 비해 IL-1α의 농도가 높게 측정됐다. Bujia 등¹¹⁾은 IL-1α가 진주종군에 43.3 pg/ml, 외이도 피부 조직에서 5.8 pg/ml로 보고했고, Sertac 등¹²⁾은 IL-1α가 진주종군에서 72.60 pg/ml, 비진주종군에서 43.01 pg/ml, 외이도 피부 조직에서 22.06 pg/ml로 측정하여 본 연구결과와 IL-1α의 절대값은 차이가 있으나 모두 진주종에서 높은 결과를 보고하고 있다. 본 연구결과와 측정치의 절대값에서 차이를 보인 것은 실험 과정 중 사용된 효소결합면역흡착검사 도구에 따라 민감도가 다르고 수술 중 조직을 채취하고 보관하는 방법에 차이가 있기 때문으로 생각된다. 그러나 절대수치의 차이에도 불구하고 각 그룹 간 차이는 통계적으로 유의하여 타 연구의 결과들과 동일하였다. TNF-α의 경우, Sertac 등¹²⁾이 측정한 연구에 따르면 진주종군에서 144.41 pg/ml, 비진주종군에서 80.34 pg/ml, 외이도 피부 조직에서 40.81 pg/ml로 보고하여 본 연구 결과와 마찬가지로 진주종군과 비진주종간의 TNF-α의 활성도 차이는 통계적으로 유의한 차이를 보였다.
IL-1α, TNF-α의 농도를 실제로 발생한 골파괴 정도와 비교하기 위해 수술전 시행한 전산화단층촬영 소견과 수술시 관찰한 소견을 기초로 골파괴 정도를 분류하였는데, 수술장 소견은 방사선 검사가 놓칠 수 있는 작은 부위의 골 미란을 확인할 수 있고 인공 음영에 의한 위양성을 막을 수 있어서 보다 정확하게 골 파괴 정도를 평가할 수 있는 방법으로 사용되고 있다. 본 연구에서 골파괴 정도와 IL-1α의 농도를 비교해 보았을 때, 골파괴가 한 부위에서만 관찰된 군이 두 부위 이상에서 골파괴가 있었던 군보다 유의하게 높은 수치를 보였고 TNF-α의 경우 골파괴 정도와 농도 간에 유의한 상관관계는 없는 것으로 관찰되었다. IL-1α와 TNF-α는 골파괴를 일으키는 중요한 사이토카인으로 받아들여지고 있지만, 골파괴가 발생한 정도와 IL-1α와 TNF-α의 농도간의 상관관계에 대해서는 여러 견해가 있다. Rika 등¹³⁾은 수술시 관찰한 소견을 기초로 골파괴 정도를 6단계로 나눠서 진주종에서 IL-1α, TNF-α adhesion molecule의 농도를 비교했는데 TNF-α의 경우 골파괴 정도와 상관관계를 갖지만 IL-1α는 골파괴 정도에 따라 유의한 차이를 보이지 않았음을 보고했고, 진주종군에서 골파괴 정도를 western blot으로 측정된 IL-1α의 발현양과 비교했을 때 상관관계가 없다는 연구결과도 있다.¹⁴⁾ 본 연구에서 골파괴가 미약한 진주종군에서 골파괴가 심한 진주종군보다 IL-1α의 농도가 높은 것은 진주종 병변이 진행되는 과정 중 골파괴가 미약한 초기단계의 염증 조직의 활성도가 높기 때문으로 생각된다. 그러나 이 결과는 중이강의 염증 상태에 대한 임상적 기술과 lipopoly-saccharide 농도 측정, 대식구와 림프구 및 섬유모세포등의 침윤정도 등을 확인하는 과정이 뒤따라야 한다. 이와 같은 진주종군의 골파괴 정도와 사이토카인 농도 간의 결과를 해석할 때 이루가 존재하는 급성 감염 상태일 경우 골파괴 정도와 상관없이 농도가 높게 측정될 수 있고, 수술시 조직의 채취 방법과 분석시 사용된 조직의 위치에 따른 오차가 초래될 수 있기 때문에 결과해석에 유의하여야 한다. 본 연구의 경우 골파괴 수준에 따른 각 군의 조직 수가 부족했고 중이의 염증상태를 반영하는 임상적 증상에 대한 기록과 활성화된 파골세포 또는 lipopolysaccharide 농도와 같은 골파괴의 정도를 직접적으로 반영하는 지표와 객관적 염증 상태를 반영하는 다른 요소에 대한 측정이 이루어지지 않아 골파괴 정도에 따른 사이토카인 농도의 상관성을 증명하는데 한계점이 있을 것으로 여겨진다. 추후 객관적 염증상태를 정량화 할 수 있는 추가적 연구가 이루어진다면 보다 체계적인 진주종의 골파괴와 관련된 기전을 이해하는 기초자료를 얻을 수 있을 것으로 사료된다.
한편 비진주종군에서 골 파괴가 관찰된 군과 골 파괴가 관찰되지 않은 군간에 IL-1α와 TNF-α의 농도가 유의한 차이를 보이지 않은 것으로 보아 비진주종성 중이염에서 관찰되는 골 파괴에 IL-1α와 TNF-α의 역할이 미미하다고 생각할 수 있다. 하지만 진주종군과 비진주중군을 합친 전체 32례의 중이염 환자 군을 대상으로 골 파괴가 있는 22례와 골 파괴가 없는 10례로 나누어 두 군간 비교해보면 골 파괴가 관찰된 군에서 사이토카인의 농도가 유의하게 높아 IL-1α와 TNF-α가 골파괴를 매개하는 중요한 인자라는 것을 유추할 수 있었다.

결     론

본 연구에서는 진주종군에서 IL-1α와 TNF-α의 농도가 비진주종군과 정상 대조군보다 통계적으로 유의하게 높았고, 골파괴가 있는 군에서 골파괴가 없는 군보다 유의하게 높은 농도가 확인되었다. 따라서 IL-1α와 TNF-α는 중이의 염증과정에 관여하고 골 파괴가 있는 진주종에서 특히 중요한 역할을 할 것으로 여겨진다.

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